Следующие 500 лет: Как подготовить человека к жизни на других планетах - Кристофер Мэйсон

Когда Шарпентье и Фогель изучили РНК бактерии, интересовавшей Шарпентье (Streptococcus pyogenes она изучала уже много лет), они заметили нечто очень странное. У этой бактерии в изобилии встречаются очень маленькие цепочки РНК (менее 100 нуклеотидов в длину), в точности совпадающие с последовательностями CRISPR, и по частоте встречаемости в клетке ДНК именно такого типа была на третьем месте. Более многочисленными у этой бактерии оказались лишь те РНК, которые заняты синтезом белков (рибосомные РНК, рРНК), и те, что опосредуют передачу информации при синтезе белков (транспортные РНК, тРНК). Это был просто шок: как настолько многочисленная единица до сих пор могла оставаться незамеченной? Все дело заключалось в ее миниатюрности и в том, что к 2011 г. стало гораздо проще секвенировать такую молекулу. Шарпентье и Фогель назвали ее «трансактивирующая CRISPR-РНК» (tracrРНК). Они доказали, что такая tracrРНК – ключевой элемент, обеспечивающий функционирование системы CRISPR. Так сложилось представление об устройстве этого «маячка».

CRISPR у человека

Благодаря трудам Дженнифер Дудны и Виргиниюса Шикшниса CRISPR превратился из любопытной особенности бактериального иммунитета в революционный инструмент. Шарпентье и Дудна познакомились в 2011 г. и начали совместно разрабатывать более простую систему генетического редактирования. Они продемонстрировали in vitro в полностью искусственной системе, что, во-первых, мультибелковая система Cascade может разрезать ДНК, во-вторых, можно использовать специально подготовленные crРНК и, в-третьих, для нормальной работы Cas9 требуется как crРНК, так и tracrРНК. Но главное, ученые показали, что эти механизмы работают, даже если объединены в направляющей молекуле РНК (sgRNA), которая комплементарна целевому участку. Таким образом, геном можно трактовать как документ, подлежащий редактированию, а эволюция приобрела новый инструментарий, созданный благодаря человеческому разуму и воображению.

Хотя удалось разгадать механизм и показать, что он должен работать в других организмах, все равно было неясно, сможет ли он функционировать в клетках млекопитающих. С 2012 по 2013 г. многочисленные эксперименты в этой сфере показали, что CRISPR действительно действует и для клеток млекопитающих. Фэн Чжан и Джордж Черч начали планировать способы тестирования этой систему в человеческих клетках. Но для этого сначала требовалось синтезировать версию фермента Cas9 с «оптимизированными кодонами» для работы в клетках человека. Это одновременно и ключевая черта генной инженерии, и важнейшая составляющая проектирования геномов как на нашей планете, так и на других.

Оптимизация кодонов – процесс, при котором белковая последовательность от одного организма (например, бактерии) подготавливается для полезного применения и экспрессии в другом организме (например, в человеческом) путем согласования частоты использования кодонов в клетках организма-реципиента. Кодоны – это промежуточный носитель информации, участвующий в центральном молекулярно-биологическом считывании (ДНК в РНК и РНК в белок), и именно из кодонов строятся многие функциональные элементы клетки. Поскольку генетический код состоит из четырех «букв», а кодон имеет три основания, общее разнообразие кодонов составляет 43 = 64. Эти 64 кодона используются почти всеми организмами на Земле, в том числе один инициаторный кодон и три кодона терминации. Таким образом, для генетического кода характерна избыточность, так как 60 кодонов используются для синтеза 20 аминокислот с участием тРНК, сопоставляющей каждую аминокислоту с тройкой кодонов в генетическом коде.

Но именно по причине такой избыточности и в силу того, что организмы развиваются и приспосабливаются в разных экосистемах, изобилие кодонов и частота их использования отличаются от вида к виду. Например, валин – это аминокислота, кодируемая четырьмя кодонами (ГУГ, ГУУ, ГУЦ и ГУА). В человеческих клеточных линиях кодон ГУГ преобладает над ГУУ и другими кодонами (в соотношении 47 % к 18 %, 24 % и 11 %), но у E. coli все иначе. В ее клетках иное предпочтение кодонов: 35 % к 28 %, 20 % и 17 % соответственно. Следовательно, если мы собираемся спроектировать белок для работы в клетках того или иного вида, то выбор кодонов в белке должен быть оптимизирован в соответствии с их нормальным использованием этих кодонов (а значит, и аминокислот) в клетках целевого вида. Сегодня использование кодонов картировано для многих видов на основе референсного генома (эти геномы записаны в базе данных GenScript). Сейчас такое картирование осуществляется без труда, однако подобное считалось почти невыполнимым, пока не накопился достаточный массив доступных для работы геномных последовательностей.

После оптимизации кодонов конструкцией нужно управлять в клетках млекопитающего. Для этого Чжан добавил в фермент Cas9 сигнал «ядерной локализации», обеспечивавший проникновение фермента в ядро человеческой клетки и разрезание ДНК. Но даже тогда функционал оставался ограниченным. Разрезание и редактирование шли не так эффективно, как надеялся Чжан. Он протестировал Cas-ферменты от разных видов и обнаружил, что вариант от S. pyogenes работает особенно хорошо. Кроме того, хотя в человеческих клетках отсутствовал набор иных бактериальных ферментов, которые могли бы обрабатывать РНК (например, бактериальная РНКаза III), они все же были в состоянии обрабатывать crРНК и функционировать. Нужную для этого последовательность трансактивирующей CRISPR-РНК также открыл Чжан. К 2012 г. он продемонстрировал, что в человеческих и мышиных клетках можно одновременно редактировать 16 сайтов, а затем ознакомился с работой Шарпентье и Дудны по направляющим РНК (sgРНК), с которыми вся система становилась еще проще. Чжан откорректировал свой вариант, показав, что с привнесенной sgРНК (решавшей часть проблем со структурированием РНК) механизм работает очень хорошо и может использоваться в биохимии млекопитающих. Действительно, Черч и Чжан продемонстрировали, что дуплекс crРНК-tracrРНК вполне работает в клетках млекопитающих. Так, наконец, биохимический арсенал бактерий оказался доступен для применения в любой клетке млекопитающих, и в частности людей.

Оптимизация CRISPR

Затем началось соревнование по усовершенствованию этой системы. В 2013 г. Дудна и Черч совместно показали, как можно прицельно отредактировать один сайт в геноме человека. Использовать и тестировать эти системы также принялись десятки других групп благодаря подспорью некоммерческого ресурса AddGene, представляющего собой репозиторий с информацией о генетических конструкциях, клетках, а также об инструментах редактирования генома и протоколах. Затем корейский ученый Чин Су Ким показал, что с помощью дуплекса crРНК-tracrРНК можно внести изменения в зародышевую линию рыбки данио-рерио. Таким образом, можно произвольно редактировать клетки млекопитающих, других позвоночных, а потенциально и вообще любые клеточные организмы. За работу по созданию этой системы, приведшей к революции в генетике, Дудна и Шарпентье были удостоены Нобелевской премии по химии в октябре 2020 г.

Но в 2018 г. обнаружилась новая проблема после того, как две независимые группы выявили, что CRISPR-редактирование приводит к непредусмотренным последствиям. Поскольку ферменты CRISPR подобны ножницам, разрезающим обе спирали ДНК, далее ДНК нуждается в репарации (восстановлении), что не ускользает от внимания клеток. Ген TP53, с которым мы познакомились в разделе о слонах, фиксировал эти повреждения и активировался, чтобы помочь при репарации ДНК и «прибрать мусор». Запускалось сканирование генома, поскольку организм фиксировал: что-то не так.

В принципе это нормальная составляющая жизненного цикла клетки. Кроме того, ген белка p53 активируется, когда клетки повреждаются в результате облучения. Именно поэтому p53 очень важен и помогает предохранять ДНК от повреждений. Чтобы клетки не становились злокачественными, он помогает запустить их самоуничтожение (этот процесс называют апоптозом), если (или когда) клетка перестает реагировать на сенсоры повреждения ДНК. Но если p53 мутирует, то этот предохранительный механизм может сломаться. Действительно, при раке – как раз когда мутирует p53 – могут внезапно появляться и быстро размножаться мутировавшие клетки. Этот эффект особенно выражен при раке яичников, когда в 95 % опухолей наблюдаются мутации в этом гене. Отсюда и задача: допустим, у вас есть набор клеток, в некоторых из них присутствует дикий (не мутантный) ген p53, а в некоторых – мутантный. После повреждения ДНК в процессе разрезания при помощи CRISPR у клеток менее предрасположенных к самоуничтожению больше шансов восстановиться и выжить, тогда как аналогичные клетки с диким типом гена p53 погибнут во благо организма.

К сожалению, именно это и происходит в CRISPR-клетках при терапии. Оказалось, что CRISPR лучше работают именно в клетках с неисправным геном p53. CRISPR тормозят один из ключевых механизмов оздоровления, из-за чего здоровые клетки вымирают, а потенциально опухолевые множатся. В принципе, это патологическая форма эволюции и давления естественного отбора. Представьте, что