Следующие 500 лет: Как подготовить человека к жизни на других планетах - Кристофер Мэйсон

Для переключения эпигенетического «тумблера» требуются новые инструменты редактирования. Но, как уже говорилось, можно учиться на биологическом материале и незачем изобретать велосипед. Как правило, метилированием цитозина управляет фермент ДНК-метилтрансфераза, преобразующий цитозин (Ц) в метилцитозин (мЦ). Метилцитозин, в свою очередь, может превращаться в гидроксиметилцитозин (гмЦ), и за это преобразование отвечает фермент TET1. Его открыли, изучая мутацию под названием «10–11 транслокация». При превращении мЦ в гмЦ процессы, происходящие в ходе «внутреннего аудита клетки», в конечном итоге преобразуют это основание обратно в цитозин и убирают ту заглушку, которая добавляется в результате действия ДНК-метилтрансферазы. Это часть нормальной циркуляции оснований в эпигеноме, которая определяет, когда и как используются гены и их регулирующие области. Мутации в TET1 и других генах семейства TET (TET2, TET3) связаны с лейкемией и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Это подчеркивает их важность в базовой эпигенетической регуляции.

При редактировании эпигенома фермент TET1 можно сочетать с модифицированной системой CRISPR для нацеливания на конкретные сайты и управление метилированием. В описываемом случае Йениш с коллегами объединил деактивированный белок Cas9 (dCas9) с ферментом TET1, а затем воспользовался одноцепочечной направляющей РНК и с ее помощью перевел ген FMR1 в активное состояние. Это позволило восстановить экспрессию гена FMR1 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC). Затем из модифицированных iPSC были получены нейроны, продемонстрировавшие вполне нормальные электрофизиологические паттерны (как у дикого фенотипа), а не аберрантные, характерные для неотредактированных нейронов с ломкой X-хромосомой. Отредактированные нейроны трансплантировали в мозг мыши, чтобы проверить, сохранятся ли внесенные изменения после возвращения в типичную для них микросреду.

Клетки смогли сохранить самоуправляемость – редактирование работало! Экспрессия FMR1 поддерживалась и в отредактированных нейронах в пересаженной мозговой ткани мыши-реципиента. Однако этот процесс не удалось корректно воспроизвести у пациентов, страдающих синдромом ломкой X-хромосомы, поскольку потребовалось бы изъять, отредактировать и заменить все их нейроны. Больной вряд ли обрадовался бы такой процедуре, учитывая, что человек постоянно пользуется мозгом и, надо полагать, дорожит своими воспоминаниями. Тем не менее Йениш с коллегами показывает, что непосредственное деметилирование повторов ЦГГ в сформировавшихся (постмитотических) нейронах мозга вполне осуществимо, равно как и восстановление экспрессии FMR1. Это означает, что независимо от причин (генетических или эпигенетических) болезнь в принципе излечима.

Эпи-эпиом

Точно как эпигенóм управляет работой ДНК, располагаясь «поверх» генома, так и эпитранскриптóм управляет работой РНК, располагаясь «поверх» транскриптома. Разработка инструментов генетического редактирования привела к появлению нового уровня над всеми контрольными переключателями. В сущности, его можно назвать «эпи-эпиóм». Редактирование эпигенома не ограничивается метилированием цитозина. Можно редактировать даже хроматин, т. е. тот каркас, который держит ДНК. Хроматин – это гибридная структура, состоящая из белка и ДНК, которая обеспечивает сложную задачу упаковки 3 млрд оснований ДНК в небольшой пакет внутри клетки, размером всего несколько микрометров. Это удивительно – ведь если вытянуть ДНК, содержащуюся в одной клетке, то перед нами окажется двухметровая молекула. Однако такая длинная ДНК не только легко умещается в клетке, но и оставляет достаточно места для того, чтобы другие молекулы могли с ней контактировать и читать ее, как только потребуется. Все равно что взять струну, которая протянулась бы от основания до верхушки самого высокого современного небоскреба (Бурдж-Халифа, 828 м), и сложить ее в коробочку, легко умещающуюся на ладони.

Такая исключительно компактная упаковка важна не только для защиты, но и для регуляции ДНК. Регуляция осуществляется белками, составляющими хроматин, и они также, подобно ДНК, поддаются модифицированию и настройке. Один из компонентов хроматина – гистоны, как и другие белки, кодируются в ДНК в составе генома, затем транскрибируются в РНК, которую в дальнейшем рибосома транслирует в уникальный белок. Гистоны представлены в клетке как два набора димеров (H2A-H2B) и один тетрамер (H3-H4), которые затем сливаются и образуют в ядре клетки октет белков (H2A-H2A-H3-H4). Некоторые гистоны (H1 или H5) играют связующую роль, но основная часть описываемых действий разворачивается в ядре. Следовательно, в большинстве проектов, связанных с эпигенетическими исследованиями, внимание фокусируется на «гистонном коде», который регулирует работу генов и находится в H2, H3 и H4.

У клеток есть множество способов управления экспрессией генов. В частности, регулирование плотности обертывания ДНК вокруг гистонов позволяет изменять степень доступности генов. Модификация, производимая поверх гистонов, позволяет прицельно открывать и замыкать хроматин. Наряду с каталогом модификаций ДНК существует обширный массив посттрансляционных модификаций (PTM), которые могут происходить (и действительно происходят) в гистонах и других белках. Так, у гистонов H3 и H4 есть длинные вьющиеся хвостики, которые очень хорошо поддаются коррекции и модификации. Эти модификации демонстрируют, как на уровне «гистонного кода» и «эпигенетического кода» клетки управляют активностью и ролью генов и белков. Список гистонных модификаций длинный и охватывает некоторые уже знакомые нам реакции, в частности метилирование и ацетилирование, но также в этот список входят такие реакции, как фосфорилирование, цитруллинирование, сумоилирование, АДФ-рибозилирование и убиквитинирование. Как и в случае с генами, видами и многими другими биологическими модальностями, продолжают появляться все новые типы модификаций. Может наступить день, когда новые PTM или гистоны будут найдены на других планетах и мы сможем воспользоваться ими на Земле.

В принципе, гистонный код похож на колоссальный коммутатор, управляющий тем, как воздействие генов проявляется в различных типах клеток и клеточных реакциях. Возвращаясь к метафоре с коммутатором, представьте себе множество разноцветных рычажков на приборном щитке в кабине пилота, которые позволяют управлять высотой, скоростью, курсом самолета, но только в руках профессионала. Посади за такой пульт ребенка – и дело окончится катастрофой. Таким образом, работая с гистонами и эпигенетическими состояниями, необходимо очень осторожно их переключать. Ферменты, предназначенные для добавления или удаления модификаций (вспомните пилота, переключающего тумблеры), именуются соответствующим образом. Например, гистоновые метилтрансферазы переносят метиловые группы в гистоны, гистоновые ацетилтрансферазы переносят ацетиловые группы в гистоны. Кроме того, для модификаций гистонов принята собственная номенклатура, которая на самом деле довольно проста: 1) название гистона, например «H3» для гистона-3; 2) указание, где именно в концевом участке гистона производится модификация, например «K4» для 4-го лизина (это аминокислота, обозначаемая буквой «К»); 3) вид модификации, так, Me означает «метилирование», а Ac – ацетилирование и 4) количество добавляемых модификаций, например 1, 2 или 3 для моно-, ди- или триметилирования. Модифицируя конкретные сайты вдоль концевых участков гистонов, (теоретически) можно заставить клетку перейти из одного состояния или типа в другой.

Однако до 2015 г. возможность заставить ферменты работать по нашей команде оставалась фантастикой. Затем появились первые работы по модификации гистонов, выполненные Тимоти Редди и Чарльзом Гершбахом. Они представили конструкции совершенно нового вида, которые подготовили почву для работ в лаборатории Йениша – о них мы говорили выше. Редди и Гершбах сконструировали ацетилтрансферазу на основе CRISPR-Cas9, в которой опять использовался обезвреженный белок Cas9 (dCas9), но в данном случае он объединялся с активным участком человеческой ацетилтрансферазы (p300). Этот гибридный белок обеспечивает ацетилирование гистона H3 в лизине 27 (H3K27Ac) и приводит к существенной активации генов-мишеней со стороны промоторов, а также генов, расположенных далеко от сайтов-мишеней (проксимальные и дистальные энхансеры). Хотя ранее предпринимались попытки работать и с другими активаторами, основанными на dCas9, их ацетилтрансфераза могла менять экспрессию генов из энхансерных областей, используя только одну направляющую РНК для нацеливания на конкретные области-мишени.

Редди и Гершбах показали, что их система является модульной и с ее помощью можно редактировать практически любую модификацию ДНК или гистонов, как только их удается открыть путем слияния домена p300 с другими белками, которые связываются с ДНК. Экспериментируя с различными комбинациями этих модификаций, можно добиться, чтобы ген делал то, что вы хотите, когда хотите и столь долго, сколько нужно. Обладая такими инструментами, мы сами превратились в сознательный регулятор и заняли новый уровень, расположенный над геномом, транскриптомом, протеомом, эпигеномом и эпитранскриптомом. Этот уровень можно назвать «эпи-эпиом».

Возрождение вымерших видов

Идеи в сфере генной инженерии иногда приходят откуда не ждали, они рождаются даже при изучении давно вымерших видов. Хотя потенциал