Следующие 500 лет: Как подготовить человека к жизни на других планетах - Кристофер Мэйсон

Но в 2019 г. в редактировании генома появились важные нововведения: стали применять праймированное редактирование. Дэвид Лю и его коллеги из Института Броуда смогли сделать более точную версию CRISPR на основе ослабленного варианта эндонуклеазы Cas9 и удлиненной гидовой РНК для праймированного редактирования (пргРНК[12]). Лю и его группа стремились оптимизировать систему CRISPR, чтобы повысить ее точность, сократить количество непредусмотренных эффектов и избежать проблем, возникающих из-за двухнитевых разрывов ДНК. Лю изменил Cas9 так, что теперь он стал разрезать только одну цепочку в двойной спирали, а не обе, – так устранялась проблема с патологическим отбором p53. Усовершенствованный механизм CRISPR прикреплялся к сайту-мишени и не только обеспечивал желаемое редактирование, но и подводил дополнительный инструмент – обратную транскриптазу (RT). Фермент RT может преобразовывать РНК в ДНК, используя в качестве матрицы содержащуюся в пргРНК информацию о том, как должен выглядеть правильный фрагмент для восстановления интересующего нас сайта.

Эту удивительную новую систему уже протестировали на различных типах клеток. Лю исправил ошибку (так называемую трансверсию в гене HBB) в одном основании, из-за которой могла возникать серповидноклеточная анемия, изменил четыре сосуществующих аллеля (возникающих из-за делеции в гене HEXA), которые могли провоцировать болезнь Тея–Сакса, встроил «защитную» трансверсию в ген PRNP, а также вставил метки и эпитопы в локусы-мишени. Всего было внесено 175 правок в человеческих клеточных линиях и в первичных постмитотических (только что разделившихся) кортикальных мышиных нейронах.

Данный метод был воспринят с большим воодушевлением, так как праймированное редактирование отличалось повышенной или схожей результативностью по сравнению с гомологичной репарацией, но давало значительно меньше побочных эффектов. В частности, при праймированном редактировании наблюдается значительно меньше промахов мимо мишени, чем при редактировании с использованием обычной нуклеазы Cas9 (с учетом, что места таких промахов для Cas9 уже известны): доля промахов снижается с 90 до 10 %. Заголовки были на зависть: праймированный подход расширяет область применения генетического редактирования и в принципе позволяет исправить до 89 % известных аллелей, вызывающих у человека генетические заболевания.

Но и эта система неидеальна, как отмечают Джонатан Уайлд и другие исследователи, работающие в данной сфере. Методы с применением пргРНК тестировались на человеческих клеточных культурах in vitro, а не в живом организме, что, очевидно, гораздо сложнее. Кроме того, накачивание клетки рестриктазами – это метод, который работает в пробирке, но в организме иммунитет может не смириться с таким воздействием. Наконец, именно при грубом подходе к активации и обратной транскрипции (ДНК в РНК) в клетке могут начаться проблемы с ретровирусами, о чем мы уже говорили выше. Итак, хотя ажиотаж вокруг этого подхода по-прежнему растет, не прекращается и поиск новых, более качественных методов редактирования генома.

Как ищут и находят новые инструменты

С 2003 г. не прекращается изучение известных бактериальных геномов в поисках новых видов CRISPR-массивов и новых типов редактирующих конструкций. В 2016 г. Омар Абудайе, Джонатан Гутенберг и Сильвана Конерман из группы Чжана открыли первую CRISPR-систему, позволяющую нацеливаться на РНК и редактировать ее (эту систему назвали Cas13a). В 2017 г. они показали, что предложенный ими метод можно применять с изотермической амплификацией, сформировав таким образом диагностику на основе CRISPR (эту технологию они назвали CRISPR-Dx). Данный метод обеспечивает быстрое обнаружение ДНК или РНК и отличается крайне высокой чувствительностью и специфичностью, которая позволяет зафиксировать несоответствие даже в одно основание. Они назвали свою диагностическую платформу SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) и уже использовали ее для выявления конкретных штаммов вируса Зика и вируса лихорадки денге, обнаружения бактерий-патогенов и даже мутаций в опухолевой ДНК. В 2020 г. этот метод был одобрен FDA для поиска вируса SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. Интересно, что реактивы, используемые в процедуре SHERLOCK, можно лиофилизировать и далее использовать на салфетке в полевых условиях, например при вспышке эпидемии.

Кроме того, продолжается поиск новых CRISPR-массивов, открывающих путь к новой биологии и позволяющих заглянуть в мир бактериофагов. CRISPR-массивы различаются по размеру, но у большинства из них есть лидерная последовательность, богатая нуклеотидами А и Т, за которой следуют короткие повторы, разделяемые уникальными спейсерами. CRISPR-повторы обычно наблюдаются с интервалом 23–55 оснований, а иногда в таких последовательностях просматривается симметрия, благодаря которой в crРНК возникают самосворачивающиеся структуры и «шпильки». Размеры спейсеров в различных CRISPR-массивах обычно составляют 21–72 основания, но, как правило, в последовательности «повтор–спейсер» в любом CRISPR-массиве меньше 50 единиц.

Новаторская работа Абудайе и Гутенберга, которую можно сравнить с работой Мохики в конце 1990-х гг., свидетельствует об интересе к изучению биологии по данным секвенирования и получению как можно большего количества метагеномных данных для поиска новых элементов и массивов CRISPR. На основании данных одного лишь проекта MetaSUB Абудайе и Гутенберг смогли открыть более 800 000 новых CRISPR-массивов, соответствующих широкому спектру микроорганизмов, перемещающихся вместе с пассажирами нью-йоркской подземки и метрополитенов других городов по всему миру. Некоторые из этих новых CRISPR-массивов и предполагаемых ферментов также исследуются в Arbor Biotechnologies и других компаниях. Эти поиски продолжатся, чтобы и далее развивать и применять новую биологию по мере секвенирования геномов у все большего числа видов.

Болезни и редактирование эпигенома

Мы только приступили к распаковке генетического инструментария, который любезно предоставила нам эволюция. Все эти инструменты нуждаются в усовершенствовании не только для повышения их безопасности, но и для обеспечения функциональности в сложном клеточном ландшафте, характерном для организма млекопитающих. Пожалуй, самое важное допущение, сделанное на третьем и четвертом этапах 500-летнего плана, заключается в том, что генная инженерия образца начала 2000-х гг. – это не последняя версия технологий, которые предстоит открыть, развить и развернуть. В будущем новые и более совершенные геномные технологии помогут нам перейти из эры редактирования геномов в эру их чистого написания. По некоторым оценкам, на Земле около одного триллиона видов, из которых мы открыли лишь несколько сотен тысяч. Кроме того, объем доступных генетических данных (например, секвенированных оснований, см. рис. 4.2) растет по экспоненте. Таким образом, с 2020 по 2040 г. нам предстоит открыть еще множество методов редактирования бактериальных и грибных геномов, работы с иммунными механизмами, способов модификации геномов. Но даже современный несовершенный инструментарий редактирования геномов позволяет излечивать некоторые заболевания.

Рис. 4.1. Рост количества генно-инженерных клинических исследований. Вверху: количество клинических исследований, инициируемых каждый год по странам. Показано только семь стран, в которых проведено наибольшее количество исследований. Больше всего исследований до 2018 г. инициировалось в США, после этого вперед вышел Китай. Внизу: типы непрерывно появлявшихся генно-инженерных исследований. Особенно заметен рост разработок терапевтических методов. В основном речь идет о терапевтических методах с применением Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T), нацеленных на лечение рака.

Рис. 4.2. Рост данных по ДНК. Количество отсеквенированных оснований растет из года в год, начиная с 1982 г. Серым показан рост базы данных GenBank, а черным – базы данных WGS. По данным сайта https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statistics.

Даже сейчас, когда всех беспокоят промахи при редактировании генома и пока мы ожидаем наступления эры «безошибочного» редактирования и написания геномов, очевиден чрезвычайный интерес к генной инженерии. С 2018 г. инициируется огромное количество клинических исследований, в которых задействованы методы ZFN, TALEN и CRISPR (рис. 4.3). В 2019 г. впервые удалось вылечить двух пациентов, один из которых страдал серповидноклеточной анемией, а другой – бета-талассемией (это патологии крови). До лечения оба пациента нуждались в постоянном переливании эритроцитов для компенсации недостатка гемоглобина, который отвечает за доставку кислорода ко всем органам и тканям. Компания CRISPR Therapeutics вместе с Vertex Pharmaceuticals разработала аутологическое лечение для этих болезней («ауто-» означает, что клетки берутся у самого пациента; при аллогенном подходе используются донорские клетки). Врачи взяли у пациентов стволовые клетки крови, модифицировали их с помощью CRISPR, чтобы отключить ген, препятствующий выработке фетального гемоглобина, а затем вновь ввели клетки пациентам. После получения такого аутологического трансплантата у обоих пациентов уровень фетального гемоглобина в крови