Следующие 500 лет: Как подготовить человека к жизни на других планетах - Кристофер Мэйсон

находились «спейсеры» (уникальные некодирующие участки ДНК между повторяющимися генами) примерно по 36 оснований в каждом. Ничего подобного Мохика ранее не видел. Результаты данного исследования он опубликовал в 1993 г. со ссылкой на работу 1987 г., проделанную группой Исино. Но природа повторов по-прежнему оставалась загадкой, и Мохика принялся анализировать новые и новые последовательности, чтобы разгадать ее.

В 1999 г. Мохика возглавил в Университете Аликанте собственную лабораторию и первым делом взялся просматривать обширные базы данных по археям в поисках повторяющихся паттернов в основном в видах Haloferax и Haloarcula. Однако он заметил регулярное проявление таких же паттернов у других видов. Это привело к всестороннему анализу новых видов по мере их появления в литературе, и к 2000 г. Мохика нашел повторяющиеся элементы в геномах 20 видов микроорганизмов. Это говорило о наличии весомой эволюционной причины для сохранения подобных повторов в ДНК организмов по всему миру. Кроме того, в 2000 г. Мохика заметил, что транскрипция прерывистых повторов (их преобразование в РНК) также происходит в клетках. Это означало, что такие повторы активируются в клетках, а не просто присутствуют в ДНК.

В 2001 г. Мохика и Рууд Янсен, также занимавшийся поиском прерывистых повторов, предложили аббревиатуру CRISPR[8] для объединения множества названий, появившихся в литературе. Это название прижилось и было быстро принято другими исследователями. Еще одной особенностью CRISPR-элементов было то, что у прокариот повторяющемуся кластеру практически всегда сопутствовала группа уникальных генов, именуемая CRISPR-ассоциированной системой, сокращенно Cas. Работа, проделанная Янсеном и Мохикой, позволила выявить и описать первые четыре Cas-гена (Cas 1–4). Затем их исследовали на уровне белков и обнаружили мотивы хеликазы и нуклеазы. Это означало, что потенциально такие ферменты могут не только разрезать, но и разматывать ДНК. Правда, если не брать в расчет эти первые гипотезы, функция CRISPR оставалась загадкой. Не было понятно, зачем именно требуются повторы.

Зачем нужны CRISPR

В одном из наиболее ярких примеров того, на что способны вычислительная биология и биоинформатика, именно компьютерный алгоритм и упорный труд принесли ключевую подсказку. Почти все лето 2003 г. Мохика работал с программой BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, помогает искать сходные аминокислотные и нуклеотидные последовательности), сравнивая наблюдаемые повторы CRISPR с другими известными последовательностями. Хотя он проделывал до этого такие операции десятки раз, повторять такой процесс стоило как можно чаще, поскольку базы данных ДНК постоянно обновляются и расширяются. Мохике повезло: он обнаружил спейсер, в точности совпадавший с фагом (вирусом, инфицирующим бактерию) P1, который может заражать кишечную палочку (E. coli). Это открытие сразу же позволило соотнести имеющуюся у бактерий адаптивную генетическую систему (массив CRISPR) с точными генетическими последовательностями у вирусов-фагов и, следовательно, открыть у бактерий новый защитный механизм. Оказалось, что у всех бактерий и архей, которые изучал Мохика, CRISPR служила в качестве первобытной иммунной системы, запоминающей вирусы, которые заражали эти микроорганизмы[9].

Эти результаты были вскоре подтверждены другими исследователями, оперировавшими иными базами данных, включая команду из Министерства обороны Франции (в том числе Жиля Верньо) и группу Александра Болотина, российского микробиолога из Французского национального института исследований в области сельского хозяйства. Дополнительная работа по оценке Yersinia pestis (чумной палочки) и других бактерий подтвердила такое соотношение между фагами и их жертвами, а также адаптивную природу всей системы. К 2003 г. сформировалась фактически совершенно новая научная дисциплина – CRISPR-исследования. В будущем такой метод сравнительного секвенирования, который помог при изучении функций CRISPR, пригодится для исследования инопланетных организмов, их биологии и адаптаций.

Довольно скоро исследовательские группы во всем мире стали раскрывать потенциал CRISPR. Первые экспериментальные доказательства (а не просто сравнения последовательностей и выводы), подтвердившие, что CRISPR являются «бактериальной иммунной системой», появились в 2006 г. благодаря Родольфу Барранжу. Затем в 2008 г. Лучано Марраффини из Чикагского университета и Эрик Зонтхаймер из Северо-Западного университета провели первые эксперименты по перепрограммированию CRISPR. Оба они работали над определением точной мишени системы CRISPR (например, РНК и ДНК) и поиском способов создания ее с нуля.

Выяснение механизмов CRISPR

Однако на тот момент еще не было ясно, как именно этот механизм работает внутри клетки. С 2007 по 2008 г. два исследователя (Муано и Даниско) занимались изучением бактерий, у которых CRISPR не работала в полную силу и которые могли быть защищены от атаки плазмид лишь частично. Они подтвердили, что разрезание плазмид зависит от Cas-фермента (в данном случае нуклеазы Cas9). Но и здесь ученые секвенировали продукты реакций и рассматривали последовательности, стремясь выявить причину этой зависимости. Исследовав данные, они обнаружили рядом с местом разреза в плазмиде набор из трех оснований, который назвали «мотив, смежный с протоспейсером[10]» (PAM). Исследователи показали, что вирусная ДНК также разрезается в определенном месте относительно PAM, т. е. PAM отчасти служит «маячком» для бактерий, которые разрезают чужеродную ДНК в определенных местах. Еще более впечатляющим был тот факт, что чем больше спейсеров у бактерии комплиментарны участкам ДНК плазмиды, тем больше разрезов делают в ней Cas-белки. Это была прицельная, дозированная система.

Вторая ключевая механистическая часть этих исследований принадлежит Джону ван дер Осту и Евгению Кунину, которые выяснили, что можно переносить целую CRISPR-систему из одной бактерии в другую, фактически «перезагружая» функцию и перепрограммируя ее. Они обнаружили различные виды CRISPR-систем у разных бактерий (класс 1 и класс 2), которые, как было отмечено, имели разные наборы Cas-ферментов. Но у всех них присутствовал определенный набор ферментов, который обеспечивал процессинг зрелых функциональных CRISPR-РНК (crРНК) из пре-crРНК и разрезание чужеродных ДНК-молекул, работая по одной схеме, названной Cascade. Ван дер Ост и Кунин обратили внимание на то, что в зрелой crРНК за восемью последними основаниями в повторе следует спейсер, а затем начинается следующий повтор. Таким образом, crРНК свертывается в функциональную структуру в виде шпильки, которая обеспечивает точное нацеливание и последующий разрез. В рамках спроектированного таким образом эксперимента они синтезировали первый в истории искусственный массив CRISPR. Фактически это настраиваемая вакцина, которую можно собрать для любой бактерии.

Два других исследователя (Марраффини и Зонтхаймер) планировали воссоздать всю систему CRISPR in vitro, но оказалось, что с выбранной ими бактерией (S. epidermidis) это слишком сложно, поскольку у нее девять Cas-генов и для ее описания требовалось много времени. Поэтому Марраффини и Зонтхаймер поступили иначе: модифицировали ту плазмиду, на которую нацеливается CRISPR-система S. epidermidis. Они добавили в нее «самосплайсинговый» элемент[11], который никак не влиял на работу CRISPR, будь та нацелена на чужеродные РНК, если CRISPR-система S. epidermidis использовала в качестве субстрата РНК. Однако если бы мишенью для CRISPR была ДНК, то иммунная система бактерии не сработала бы, поскольку в таком случае после вставки дополнительной последовательности спейсер CRISPR уже не подходил бы к протоспейсеру. Результаты показали, что CRISPR направлена на ДНК, а не на РНК и фактически является «программируемым ферментом-рестриктазой». Марраффини и Зонтхаймер первыми объявили, что CRISPR можно переориентировать на редактирование генома в других клетках, в том числе в человеческих. В своей статье они отметили: «С практической точки зрения способность направлять специфическую адресную деструкцию молекулы ДНК, содержащей любую заданную последовательность–мишень, состоящую из 24–48 нуклеотидов, могла бы иметь значительную функциональную пользу, в особенности если такая система могла бы работать вне своей исходной бактериальной или архейной клетки».

Последний элемент этой мозаики отыскали в 2011 г. Эмманюэль Шарпентье и Йорг Фогель. Шарпентье искала бактериальные РНК, которые обладали бы нужной функцией, и на одной конференции в Висконсине повстречала Фогеля. Незадолго до того он освоил высокопроизводительное секвенирование (секвенирование следующего поколения, NGS). Этот метод помог ему лучше изучить РНК Helicobacter pylori, бактерии, которая может вызывать язву желудка. Такое секвенирование «методом дробовика» действительно соответствует своему названию. При таком подходе РНК или ДНК разрываются на фрагменты, которые затем секвенируются. Секвенированные фрагменты можно сопоставлять с последовательностями ДНК из генома хозяина, зафиксированными в базах данных. Аналогичную работу Мохика проделывал при помощи алгоритма BLAST, работая в Испании летом 2003 г. Консорциум MetaSUB