Кошки, гены и эволюция - Павел Михайлович Бородин

бактериальных ферментов, которые режут ДНК по определенным коротким последовательностям. Затем эти фрагменты копируют (реплицируют) в пробирке с использованием нуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями.

А потом происходит самое интересное. Смесь фрагментов ДНК определенного кота наносят на панель. Фрагменты ДНК гибридизуются (химически склеиваются) с комплементарными им последовательностями на чипе. Сила склеивания зависит от степени комплементарности. Фрагменты из середины хромосомы А1 не гибридизуются с лункой, где приклеен фрагмент конца этой же хромосомы или любого другого района генома. С этой лункой гибридизуется только гомологичный ей фрагмент из генома нашего кота, причем наиболее сильно приклеится именно тот фрагмент, где совпадают средние нуклеотиды. Потом чип промывают, так что все случайно и слабо склеенные фрагменты смываются, а остаются только точно и сильно склеенные. Далее лазер регистрирует свечение каждого сегмента каждой лунки. Он показывает, что в лунке, соответствующей району ОНП, который находится на расстоянии 3 456 789 нуклеотидов от начала хромосомы А1 у кота по кличке Буцефал, светится сегмент А, а у его сестры, кошки по кличке Бургунди, – и сегмент А, и сегмент Г, а у их сродного брата Арго – только сегмент Г. Так мы узнаем генотипы наших котов по каждому из 340 тысяч районов генома. Только зачем нам это надо?

Давайте разберем это на конкретной работе исследователей из Корнельского университета188. При этом университете уже много лет работает ветеринарная клиника, через которую прошли тысячи кошек с разными диагнозами. Образцы ДНК и диагнозы 1122 кошек и послужили материалом для полногеномного анализа ассоциаций девяти распространенных кошачьих заболеваний. С использованием своего чипа на 340 тысяч ОНП исследователи генотипировали их всех.

Прежде всего, они проверили, как работает их система, ловит ли она известные ассоциации. Для этого ученые выбрали среди генотипированных животных 90 рыжих и 121 нерыжую кошку. Затем они определили, какие ОНП встречаются среди рыжих достоверно чаще, чем среди нерыжих. Как и ожидалось, рыжие достоверно отличались от нерыжих по 25 ОНП, локализованным на Х-хромосоме между 102 884 842 и 112 136 902 139 нуклеотидами от ее начала, в то время как по остальным ОНП они практически не различались.

Убедившись на этом опыте, что их система работает, исследователи перешли к поиску вариантов генов, связанных с болезнями. В их список входили самые распространенные кошачьи болезни: гипертрофическая кардиомиопатия, гипертиреоз, сахарный диабет, хроническая болезнь почек, хроническая энтеропатия и четыре другие. Подход использовали тот же: выбрали среди генотипированных животных группу больных и группу здоровых и искали ОНП, которые чаще встречались среди больных, чем среди здоровых. Так они обнаружили, что предрасположенность к диабету ассоциирована с районом вокруг нуклеотида 83 583 678 от начала хромосомы D4. Аллель А выявляли достоверно чаще у больных кошек (37%), чем у здоровых (17%).

Как видите, эта ассоциация не абсолютна. Далеко не все больные кошки имеют этот аллель, а у некоторых здоровых он тоже есть. Почему это так?

Потому что “ассоциированный” аллель чаще всего маркирует не сам ген, который вызывает болезнь, а район генома, где этот ген находится. Как правило, предрасположенность к заболеваниям контролируется многими генами, и найденный в обнаруженном нами районе ген предрасположенности не единственный, а один из множества. Так, кроме района вокруг 83 583 678 нуклеотида от начала хромосомы D4, значимые ассоциации с диабетом показали хромосомы A3, B1 и E1.

Что же за гены находятся в районах, которые оказались ассоциированными с диабетом? Район вокруг 83 583 678 нуклеотида от начала хромосомы D4 содержит много генов обонятельных рецепторов. Эти рецепторы кроме самих запахов определяют вкус и аппетит. Аллельные варианты, ассоциированные с диабетом, могут способствовать риску ожирения и следующего за ним диабета. Кроме того, было показано, что один из генов обонятельных рецепторов у мышей активен в клетках поджелудочной железы и регулирует секрецию инсулина. В ассоциированном районе хромосомы B1 находится ген меланокортина 4, мутации которого тоже приводят к ожирению.

Вот, кстати, еще одна причина, почему ассоциации районов хромосом с болезнями не стопроцентны. Гены контролируют не сами болезни, а предрасположенности к ним. У котов – носителей опасных аллелей могли быть разумные хозяева, которые держали своих питомцев на диете, предохраняя их от ожирения.

Полногеномный анализ ассоциаций позволяет картировать гены количественных признаков, таких, например, как рост, длина хвоста или особенности поведения. Пример такого анализа, который пока не провели, показан на рисунке 11–2. Генетики должны прогенотипировать тысячи кошек и измерить длины их хвостов. Затем они должны найти те районы генома, которые различаются у кошек разной хвостатости. В нашем умозрительном примере носители генотипа Г/Г – самые длиннохвостые, у гетерозигот Г/А хвосты в среднем чуть короче, а у гомозигот А/А – еще меньше (рис. 11–2). На нашем умозрительном рисунке мы сильно преувеличили различия в хвостах между генотипами. На самом деле (если мы не включаем в анализ бобтейлов и мэновских бесхвостых) даже самые сильные аллели вряд ли изменяют хвост больше, чем на несколько миллиметров.

Здесь мы вынуждены еще раз сказать, что полногеномный анализ ассоциаций не находит сами гены болезней и количественных признаков. Он только указывает на области генома, где их надо искать.

После того как район поиска очерчен, начинается его прочесывание мелким гребнем. Этот район секвенируют и определяют, что в нем находится. Если там находят гены (то есть последовательности, снабженные промоторами), то пытаются определить, что это за гены, чем аллели больных животных отличаются от аллелей здоровых животных, какие мутации чаще встречаются у короткохвостых котов по сравнению с длиннохвостыми. Где эти мутации – в интронах или в экзонах? Если в интронах, то где – где-то в середине или на краю, в точках сплайсинга? Если в экзонах, то в каких позициях кодонов: в первой, второй или третьей? Если за пределами генов, то нет ли там энхансеров, сайленсеров или каких-то других последовательностей, управляющих активностью генов? Какие белки могут связываться с этими последовательностями? Это только малая часть вопросов, которые пытается решить генетик, поймав достоверную ассоциацию между ОНП и признаком.

Рис. 11–2. Анализ ассоциаций между вариантами ОНП и количественным признаком.

Полногеномный анализ ассоциаций – это сейчас главный инструмент предиктивной медицины, нутригенетики и психологии. Давайте еще раз потренируемся на людях, посмотрим, как это работает.

Несколько лет назад Павел Бородин отдал свой драгоценный геном на анализ в четыре фирмы, которые специализируются на секвенировании и интерпретации человеческих геномов. Они его прочипировали[77] и выдали сотни интерпретаций. Рассмотрим две.

Бородину посулили никотиновую зависимость – “состояние патологического влечения к табаку (сигарет, сигар, сигарилл, курительных трубок или кальяна)”. Вероятность того, что у него есть никотиновая зависимость, они оценили в 56%. Это значит, что никотиновая зависимость была у 56 из 100 мужчин, клиентов этой фирмы в его возрасте и с похожими вариантами ОНП, ассоциированными с никотиновой зависимостью. По мнению исследователей, наибольшая вероятность развития этого пристрастия у него была в возрасте 29 лет. Она составляла 74%. Интересно, что, по их мнению, с